孫煥波(個(gè)體經(jīng)營）

毛白楊屬楊柳科楊屬，是我國特有樹種，樹干通直，高大，適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，是用材林和城鄉(xiāng)綠化的優(yōu)良樹種，其優(yōu)株的無性系苗木，生長速度比普通毛白楊快15%～20%，經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高。但用常規(guī)無性繁殖時(shí)，如扦插、壓條等，很難生根，加之繁殖材料有限，不僅用材多，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，而且成活率低，繁殖系數(shù)不大，很難在短期內(nèi)繁殖大量苗木。試管快繁對于毛白楊來說，無論在理論上和生產(chǎn)實(shí)踐上均具有重要的意義。目前，毛白楊的試管快繁技術(shù)已在造林育苗的生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。我們用植物組織培養(yǎng)法進(jìn)行毛白楊的快速繁殖，在短時(shí)間內(nèi)收到了良好的效果。
1外植體的選擇與滅菌
1.1外植體脫毒
選擇品種優(yōu)良、健壯的植株進(jìn)行盆栽，溫度逐漸提高到35～38℃。在這溫度下培養(yǎng)2個(gè)月，這期間要注意肥水的管理，以減輕高溫處理造成的死苗現(xiàn)象。剝?nèi)∏o尖和腋芽。切取頂芽或腋芽3cm左右大小，去掉葉片，保留護(hù)嫩葉柄。用清水反復(fù)沖洗干凈。用70%的灑精浸10s，用無菌水沖洗3次。0.1%氯化汞浸5min倒出后用無菌水沖洗3～5次。取出用濾紙進(jìn)行吸干。在解剖鏡下，將材料置于無菌的濾紙上，剝嫩苞葉，露出錐形體，切取0.5mm長度的莖尖，帶有2個(gè)葉原基，迅速接種到培養(yǎng)基上，防止莖尖脫水再要注意的一點(diǎn)是不要倒置。
莖尖剝離的大小是脫毒效果的關(guān)鍵技術(shù)。莖尖剝離越小，脫除病毒的效果越好，但接種不易成活；莖尖剝離得越大，接種成活越高，但脫除病毒的效果差。結(jié)合熱處理進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，操作簡便，容易掌握，脫除病毒的效果好。
1.2休眠芽的外植體的選擇與滅菌
毛白楊在初代培養(yǎng)時(shí)也可以采用休眠芽作為外植體，取當(dāng)年形成的直徑在5mm左右健康無病蟲害的枝條，用解剖刀切成長度為1.5～2.0cm的節(jié)段，每個(gè)節(jié)段帶休眠芽。
將切段先用自來水沖洗干凈，再用70%～75%酒精浸泡30s同時(shí)不斷用玻璃棒攪動(dòng)，目的是能夠使外植體的表面能夠充分與酒精接觸進(jìn)行消毒。倒掉酒精后，立即用無菌水沖洗3～5遍，沖洗去殘留的酒精。然后用5%的次氯酸鈉溶液或用0.1%氯化汞溶液進(jìn)行浸泡7～8min，倒掉這些消毒液，再用無菌水沖洗3～5遍。在無菌操作臺上將外植體取出放在已滅好菌的濾紙上吸去殘留的水分，放在另一張已滅菌的濾紙上進(jìn)行切割成帶有1個(gè)葉芽的莖段。
1.3葉片外植體的選擇與滅菌
毛白楊在初代培養(yǎng)時(shí)也可以采用葉片做為外植體。
將葉片先用自來水沖洗干凈，再用70%～75%酒精浸泡10s同時(shí)不斷用玻璃棒攪動(dòng)，目的是能夠使外植體的表面能夠充分與酒精接觸進(jìn)行消毒。倒掉酒精后，立即用無菌水沖洗3～5遍，沖洗去殘留的酒精。然后用5%的次氯酸鈉溶液或用0.1%氯化汞溶液進(jìn)行浸泡7～8min，倒掉這些消毒液，再用無菌水沖洗3～5遍。在無菌操作臺上將外植體取出放在已滅好菌的濾紙上吸去殘留的水分，放在另一張已滅菌的濾紙上將葉片切成5mm×5mm。
2外植體的接種
2.1操作人員需著經(jīng)滅菌物白色工作服，戴口罩。進(jìn)行人接種室前，工作人員的雙手必須進(jìn)行滅菌，用肥皂水充分洗滌，操作前再用70%的酒精擦洗雙手。
2.2操作期間經(jīng)常用70%的酒精擦拭雙手和臺面。特別注意防止“雙重傳遞”的污染。
2.3在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時(shí)，較大的污染危險(xiǎn)是管口邊沿沾染的微生物落入管內(nèi)。解決這個(gè)問題，可在打開前用火焰燒瓶口。
2.4工具用后及時(shí)滅菌，避免交叉污染。
2.5由于空氣中有灰塵，因此在操作時(shí)，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)打開瓶子或試管時(shí)，應(yīng)在酒精燈前與水平面成45°角，右手將已切割好的外植體用鑷子放在培養(yǎng)基中（但是外植體不夾的過緊或過松），之后將瓶蓋在火焰上燒一下蓋上即可。
3培養(yǎng)基的成分
預(yù)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基的成分是：MS＋0.5mg/LBA＋100mg/L水解乳蛋白，經(jīng)1周的觀察將沒有被污染的外植體轉(zhuǎn)接正式誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基：MS＋0.5mg/LKT＋0.02mg/LNAA＋100mg/L賴氨酸＋3%蔗糖。培養(yǎng)室的溫度在25～27℃，日光燈連續(xù)照射16h，光強(qiáng)為15001x左右；經(jīng)1個(gè)月培養(yǎng)莖段（莖尖大約在2～3個(gè)月）可以分化出芽，愈傷培養(yǎng)基：MS＋0.2mg/LBA＋0.02mg/LNAA＋100mg/L將葉片放在愈傷培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，產(chǎn)生后將其愈傷組織放在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS＋1.5%蔗糖；兩周左右培養(yǎng)，即可長成帶有4～5個(gè)葉健壯的無根小植株。生根培養(yǎng)基為：1/2MS＋0.2mg/LIBA＋0.02mg/LNAA＋3%活性炭＋1.5%蔗糖；12h的光照與黑暗交替；光強(qiáng)為1500lx經(jīng)1個(gè)月左右培養(yǎng)，即可長成帶有6～7個(gè)葉健壯完整小植株。
4擴(kuò)大繁殖
4.1莖切段生芽擴(kuò)大繁殖法
將由莖尖（莖段）誘導(dǎo)出的幼芽從基部切下，轉(zhuǎn)接到新配制的壯苗培養(yǎng)基上。壯苗培養(yǎng)基為1/2MS＋1.5%蔗糖。經(jīng)1個(gè)月左右培養(yǎng)，即可長成帶有4～5個(gè)葉健壯的小植株。將小苗進(jìn)行切割成帶有葉的莖段再次分別插入分化培養(yǎng)基中如此反復(fù)循環(huán)即可獲得大批的無根苗。這時(shí)將這些無根苗分別插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根。
4.2葉切塊生芽擴(kuò)大繁殖法
每片葉從基部中脈處切取1cm×1cm并帶有約0.5cm長葉柄的葉切塊，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，注意的是要將葉的被面貼在培養(yǎng)基上。可從葉柄的切口處觀察到有芽出現(xiàn)。之后逐漸增多成簇。每個(gè)葉切塊可得20余個(gè)叢芽。將這些芽切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中可得到完整的小植株。
5誘芽的影響因素
5.1不同無機(jī)鹽濃度的影響
不同無機(jī)鹽濃度的對比試驗(yàn)，采用MS和1/2MS大量元素兩種濃度。對比結(jié)果，以高濃度的無機(jī)鹽對誘芽的效果為好，在低鹽濃度的培養(yǎng)基上芽的誘導(dǎo)率幾乎減少一半。
5.2不同激素水平的影響
進(jìn)行了3種激素水平的對比試驗(yàn)，KT用量全同，只NAA的用量不同。從添加NAA0.002mg/L處理看，誘芽率皆低，只NAA的用量加大到NAA0.02mg/L時(shí)，則表現(xiàn)較好，當(dāng)NAA0.1mg/L時(shí)則誘芽率又都有下降的趨勢。
5.3不同培養(yǎng)瓶的誘芽情況
從100ml三角瓶和500ml廣口瓶的誘芽對比試驗(yàn)看，經(jīng)1個(gè)月培養(yǎng)，廣口瓶誘芽情況大大優(yōu)于三角瓶，芽數(shù)幾乎多1倍。
5.4不同途徑培養(yǎng)對比
以0.5mm長的莖尖培養(yǎng)得到大量正常的植株，在添加一些生長素等物質(zhì)。表面具有分生能力的愈傷組織，重復(fù)繼代培養(yǎng)仍可保持植株再生能力。大大超過傳統(tǒng)的方法，且比用誘導(dǎo)側(cè)芽的方法也高得多。
6移栽與管理
6.1嫩莖試管生根
切取3cm左右試管苗無根嫩莖，轉(zhuǎn)插到1/2MS＋NAA（IBA）0.1～0.5mg/L培養(yǎng)基上，經(jīng)7～10d即可達(dá)到生根率80%，12d生根率可達(dá)100%。在無植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基上，生根率90%～100%。
6.2無根嫩莖的扦插
將試管苗無根嫩莖切段，直接扦插到介質(zhì)中生根。切段基部經(jīng)生根粉處理，2周后生根率達(dá)90%。免去試管生根的這一環(huán)節(jié)，降低了成本，縮短生產(chǎn)時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率。
試管苗生根后，連瓶苗一起放入室，以適應(yīng)光照和溫濕度。3～5d后，打開瓶口取出試管苗，按一定株行距置于細(xì)砂或粗蛭石介質(zhì)中，加蓋拱棚覆膜保持溫度和濕度。5d后逐漸揭膜見光，及時(shí)通風(fēng)換氣，定期噴肥和噴藥，防止有菌類的污染，提高試管苗的成活率。